DNA İzolasyonu Protokolü

**Jade** · 06.04.2014, 15:49

DNA İzolasyonu Protokolü

DNA İZOLASYON PROTOKOLÜ
DNA İzolasyonu hangi aşamalardan oluşmaktadır?

DNA izolasyonu temelde 2 aşamadan meydana gelir.
1. Hücre duvarının parçalanması
2. DNA-protein kompleksinin çözülmesi ve diğer moleküllerden ayrılması

Hücre Duvarının Parçalanması: Hücrenin çekirdeğindeki DNA’ya ulaşmak için hücre duvarının parçalanması gerekmektedir. Parçalama fiziksel ve kimyasal yollarla yapılabilir. Fiziksel olarak ısıtılan hücreler aynı zamanda kimyasal karışımlara tabi tutularak duvarın parçalanması sağlanır. Bu kimyasal karışım içinde bulunan tuz, hücre duvarından geçerek proteinleri DNA’ dan ayırır. Deterjan ise hücre duvarının geçirgenliğini arttırarak hücre içeriğinin serbest kalmasını sağlar. EDTA magnezyumu bağlayarak DNaz aktivitesini inhibe eder böylece DNA stabil halde kalabilir. Protein parçalayıcı enzimler ise hücre içeriğindeki proteinleri parçalayarak, sonraki aşamalar açısından homojen bir karışım oluşmasını sağlamaktadırlar. Hücre içinde bulunan RNA’lar tek iplikçik halde stabil olabildiklerinden onların da ortamdan uzaklaştırılması gerekir ve bunun için de RNaz enzimi kullanılır.

Parçalama aşamasında kullanılan kimyasallar ve süre DNA’sını elde etmek istediğiniz materyale göre değişiklik gösterebilir. Örneğin, bazı bakterilerin DNA’sını elde ederken, farklı yapıdaki duvarı için lizozim adlı farklı bir enzim kullanılır ve süre daha uzun tutulabilir. Yine aynı şekilde kandan DNA izolasyonu için harcanan parçalama süresi, dokudan DNA izolasyonu için harcanan süreden daha azdır.

DNA-Protein Kompleksinin Çözülmesi ve Diğer Moleküllerden Ayrılması: Bu yöntem genellikle denatürasyona dayanır. Ancak günümüzde teknolojinin de gelişimi ile DNA’yı tutma özellikli spin kolonları da kullanılmaya başlamıştır. Denatürasyona dayalı kimyasal çözülmede çoğunlukla fenol ekstraksiyonu işlemi kullanılır. Fenol ile proteinler ve DNA fragmanları birbirinden ayrılır ve uzaklaşmaları sağlanır.
Spin kolonlarının kullandığı fiziksel çözülmede ise, özel solüsyonlar ile DNA’nın tüpler içine özel olarak yerleştirilen matriks tabakasına tutunması sağlanır. Aynı aşamada DNA haricindeki moleküller matrikse tutunamadığı için ortamdan uzaklaşır. Spin kolonlar belirli solüsyonlar ile yine DNA harici maddelerin tamamen uzaklaşması için “yıkama” denilen işleme tabi tutulurlar. Son aşamada ise DNA ile matriksi birbirinden elimine eden solüsyonların kullanıldığı “Elüsyon” aşaması vardır ve bu aşama ile birlikte DNA son halini almaktadır.

Elde edilen DNA’nın saflık ve miktar belirlenmesi nasıl yapılmaktadır?
PCR aşamasında elde edilen DNA’dan reaksiyon başına yaklaşık olarak 40–100 ng kullanılır. DNA konsantrasyonu ve elde edilen DNA’nın temizliği spektrofotometre kullanılarak değerlendirilir. Bu amaçla 260/280 absorbans değerlerinin ölçülebildiği bir UV spektrofotometreye ihtiyaç duyulmaktadır.

DNA' nın miktar ve saflığı, spektrofotometrede 260 ve 280 nm dalga boylarında elde edilen değerlerden belirlenmektedir. Optik dansite (OD) çift iplikli DNA için 50 μg/ml, tek iplikli DNA veya RNA için 40 μg/ml ve oligonükleotidler için 20 μg/ml' ye karşılık gelmektedir. Örnek olarak çift iplikçikli DNA için miktar tayininde aşağıdaki formülden yararlanılmaktadır;

DNA (μg/ml)=260 nm'deki OD (Absorbans değeri) x sulandırma oranı x 50

DNA’nın temizliği için A (260 /280) ve A (260 /230) değerlerine bakılmaktadır. Çünkü DNA 260, protein 280 ve karbonhidratlar da 230 nm dalga boylarında pik (en yüksek değer) yapmaktadır. Temiz bir DNA’ da A (260 /280) oranı 1.80 ile 2.00 arasında; A (260 /23 0) oranı ise 2.00 den büyük; A (320) ise 0’ a yakın olmalıdır. 1.8’in altında elde edilen A (260 /280) değeri protein kontaminasyonunu, 2’nin üzerinde elde edilen A (260/280) değeri de RNA kontaminasyonunu işaret etmektedir. PCR yönteminde ne kadar saf ve yüksek molekül ağırlıklı DNA izole edilebilirse bantların belirginliği ve üretilebilirliği o derece artmaktadır.

Dr. Zeydanlı DNA İzolasyon yöntemi hangi aşamalardan oluşmaktadır?
DZ DNA İzolasyon Kiti, fenol/kloroform yöntemine dayalı bir kittir. Parçalayıcı enzim ile inkübasyon sonrasında fenol/kloroform ile bir araya getirilen DNA molekülleri, alkol ile proteinlerden ayrıştırılarak DNA eldesi tamamlanır.

Dr. Zeydanlı DNA İzolasyon yöntemi ile hangi materyallerden DNA elde edilebilir?
Bu metot ile serumdan, kandan, lökositten, tükürükten, parafine gömülü doku örneklerinden, sürüntüden ve gaitadan DNA izolasyonu yapılabilir. Farklı örneklerden izolasyon aşamaları aşağıda gibidir;

Serumdan DNA İzolasyonu;

1,5 ml nükleaz free tüp içine 500 µl Sol B, 25 µl Sol A ve 250 µl serum koyulur. Vortekslenir ve 42 °C ‘de 1 saat inkübe edilir.
Tüpler üzerine 500 µl Sol C koyulur (Sol C, iki fazlı bir solüsyondur. Alt fazından alınması gerekmektedir). Vortekslenir (Süt renginde bir sıvı oluşması beklenir) 10.000 rpm’de 5 dk santrifüj edilir.
Oluşan 2 fazdan, üst kısımdaki berrak faz alınarak (~500 µl) temiz bir 1,5 ml nükleaz free tüpe koyulur. Üzerine 500 µl Sol D koyulur. Hafifçe vortekslenerek 10.000 rpm’de 10 dk santrifüj edilir.
Süpernatant atılır ve üzerine 500 µl Sol E koyulur. 10.000 rpm’de 5 dk santrifüj edilir.
Süpernatant atılır. Tüpler 37 °C etüv veya kuru ısıtıcılı blok yardımı ile kurutulur. Kuruduktan sonra 50 µl distile su ile sulandırılır ve serum içerisindeki mikroorganizma DNA’sı elde edilmiş olur.

Parafine Gömülü Dokudan DNA İzolasyonu;
0,2 µm kesitler alınmış örneklerden leblebi büyüklüğünde 1,5 ml nükleaz free tüpe alınır.
Üzerine 1 ml Ksilen eklenir. Tüp hafifçe alt üst edilerek parafinin çözülmesi sağlanır. Bu şekilde oda sıcaklığında birkaç dakika beklenir. Doku, 5000 rpm’de 1 dk santrifüj edilerek çöktürülür ve süpernatant pipet yardımıyla uzaklaştırılır.
Pelet üzerine tekrar 500µl Ksilen eklenir ve tüp alt üst edilerek yine santrifüj yapılır parafin iyice temizlenir. Süpernatant pipet yardımıyla uzaklaştırılır.
Pelet üzerine Ksilen’ i uzaklaştırmak için 1 ml % 99’luk alkol koyulur ve alt üst edilerek karıştırılır, 5000 rpm’ de 1 dk santrifüj edilerek doku çöktürülür. Süpernatant pipet yardımıyla uzaklaştırılır.
İkinci yıkama 750 µl % 75’lik alkolle ve 3. yıkama işlemi ise 750 µl dH2O ile yapılır. Her defasında tüp hafifçe çalkalanır, çöktürülür ve süpernatant uzaklaştırılır.
Bu işlemle doku parafinden arındırılmış olur.

Elde edilen örnek ile 1. adımdan itibaren devam edilerek izolasyon tamamlanır.

Tükürükten DNA İzolasyonu;
Tükürük örnekleri bir 50 ml tüp içerisindeki ~1ml Sol B içerisine alınır. Sol B içerisinde 6 ay oda sıcaklığında saklanabilir.
Solüsyon içerisindeki tükürük örneği ile 1. adımdan itibaren devam edilerek izolasyon tamamlanır.

Gaitadan DNA İzolasyonu;
Mercimek büyüklüğündeki gaita örneği 1,5 ml tüp içerisine alınır. Üzerine 750 µl kadar Nükleaz free steril su koyulur.
Yaklaşık 10 sn vortekslenerek 3000 rpm de 1 dk çevirilir.
Süpernatant (~750 µl) temiz bir 1,5 ml tüpe alınır ve bu şekli ile yıkama işlemi 3 kere tekrarlanır. Her defasında pelet atılır ve süpernatant üzerinden işlem yapılır.
En son alınan süpernatant (~500 µl) örneği ile 1. adımdan itibaren devam edilerek izolasyon tamamlanır.

Sürüntüden DNA İzolasyonu;
Sürüntü pamuk uçlu eküvyon ile alınmışsa;
1,5 ml tüp içine 500 µl Sol B koyulur. Eküvyonun örnek alınmış ucu tüp içine daldırılır ve 10 dk bekletilir.
Eküvyon alınır tüp içine Sol A eklenerek 1. adımdan itibaren devam edilerek izolasyon tamamlanır.

Alıntıdır.

06.04.2014, 15:49	#1 (permalink)
Jade Kullanıcıların profil bilgileri misafirlere kapatılmıştır.	DNA İzolasyonu Protokolü *DNA İzolasyonu Protokolü* DNA İZOLASYON PROTOKOLÜ DNA İzolasyonu hangi aşamalardan oluşmaktadır? DNA izolasyonu temelde 2 aşamadan meydana gelir. 1. Hücre duvarının parçalanması 2. DNA-protein kompleksinin çözülmesi ve diğer moleküllerden ayrılması Hücre Duvarının Parçalanması: Hücrenin çekirdeğindeki DNA’ya ulaşmak için hücre duvarının parçalanması gerekmektedir. Parçalama fiziksel ve kimyasal yollarla yapılabilir. Fiziksel olarak ısıtılan hücreler aynı zamanda kimyasal karışımlara tabi tutularak duvarın parçalanması sağlanır. Bu kimyasal karışım içinde bulunan tuz, hücre duvarından geçerek proteinleri DNA’ dan ayırır. Deterjan ise hücre duvarının geçirgenliğini arttırarak hücre içeriğinin serbest kalmasını sağlar. EDTA magnezyumu bağlayarak DNaz aktivitesini inhibe eder böylece DNA stabil halde kalabilir. Protein parçalayıcı enzimler ise hücre içeriğindeki proteinleri parçalayarak, sonraki aşamalar açısından homojen bir karışım oluşmasını sağlamaktadırlar. Hücre içinde bulunan RNA’lar tek iplikçik halde stabil olabildiklerinden onların da ortamdan uzaklaştırılması gerekir ve bunun için de RNaz enzimi kullanılır. Parçalama aşamasında kullanılan kimyasallar ve süre DNA’sını elde etmek istediğiniz materyale göre değişiklik gösterebilir. Örneğin, bazı bakterilerin DNA’sını elde ederken, farklı yapıdaki duvarı için lizozim adlı farklı bir enzim kullanılır ve süre daha uzun tutulabilir. Yine aynı şekilde kandan DNA izolasyonu için harcanan parçalama süresi, dokudan DNA izolasyonu için harcanan süreden daha azdır. DNA-Protein Kompleksinin Çözülmesi ve Diğer Moleküllerden Ayrılması: Bu yöntem genellikle denatürasyona dayanır. Ancak günümüzde teknolojinin de gelişimi ile DNA’yı tutma özellikli spin kolonları da kullanılmaya başlamıştır. Denatürasyona dayalı kimyasal çözülmede çoğunlukla fenol ekstraksiyonu işlemi kullanılır. Fenol ile proteinler ve DNA fragmanları birbirinden ayrılır ve uzaklaşmaları sağlanır. Spin kolonlarının kullandığı fiziksel çözülmede ise, özel solüsyonlar ile DNA’nın tüpler içine özel olarak yerleştirilen matriks tabakasına tutunması sağlanır. Aynı aşamada DNA haricindeki moleküller matrikse tutunamadığı için ortamdan uzaklaşır. Spin kolonlar belirli solüsyonlar ile yine DNA harici maddelerin tamamen uzaklaşması için “yıkama” denilen işleme tabi tutulurlar. Son aşamada ise DNA ile matriksi birbirinden elimine eden solüsyonların kullanıldığı “Elüsyon” aşaması vardır ve bu aşama ile birlikte DNA son halini almaktadır. Elde edilen DNA’nın saflık ve miktar belirlenmesi nasıl yapılmaktadır? PCR aşamasında elde edilen DNA’dan reaksiyon başına yaklaşık olarak 40–100 ng kullanılır. DNA konsantrasyonu ve elde edilen DNA’nın temizliği spektrofotometre kullanılarak değerlendirilir. Bu amaçla 260/280 absorbans değerlerinin ölçülebildiği bir UV spektrofotometreye ihtiyaç duyulmaktadır. DNA' nın miktar ve saflığı, spektrofotometrede 260 ve 280 nm dalga boylarında elde edilen değerlerden belirlenmektedir. Optik dansite (OD) çift iplikli DNA için 50 μg/ml, tek iplikli DNA veya RNA için 40 μg/ml ve oligonükleotidler için 20 μg/ml' ye karşılık gelmektedir. Örnek olarak çift iplikçikli DNA için miktar tayininde aşağıdaki formülden yararlanılmaktadır; DNA (μg/ml)=260 nm'deki OD (Absorbans değeri) x sulandırma oranı x 50 DNA’nın temizliği için A (260 /280) ve A (260 /230) değerlerine bakılmaktadır. Çünkü DNA 260, protein 280 ve karbonhidratlar da 230 nm dalga boylarında pik (en yüksek değer) yapmaktadır. Temiz bir DNA’ da A (260 /280) oranı 1.80 ile 2.00 arasında; A (260 /23 0) oranı ise 2.00 den büyük; A (320) ise 0’ a yakın olmalıdır. 1.8’in altında elde edilen A (260 /280) değeri protein kontaminasyonunu, 2’nin üzerinde elde edilen A (260/280) değeri de RNA kontaminasyonunu işaret etmektedir. PCR yönteminde ne kadar saf ve yüksek molekül ağırlıklı DNA izole edilebilirse bantların belirginliği ve üretilebilirliği o derece artmaktadır. Dr. Zeydanlı DNA İzolasyon yöntemi hangi aşamalardan oluşmaktadır? DZ DNA İzolasyon Kiti, fenol/kloroform yöntemine dayalı bir kittir. Parçalayıcı enzim ile inkübasyon sonrasında fenol/kloroform ile bir araya getirilen DNA molekülleri, alkol ile proteinlerden ayrıştırılarak DNA eldesi tamamlanır. Dr. Zeydanlı DNA İzolasyon yöntemi ile hangi materyallerden DNA elde edilebilir? Bu metot ile serumdan, kandan, lökositten, tükürükten, parafine gömülü doku örneklerinden, sürüntüden ve gaitadan DNA izolasyonu yapılabilir. Farklı örneklerden izolasyon aşamaları aşağıda gibidir; Serumdan DNA İzolasyonu; 1,5 ml nükleaz free tüp içine 500 µl Sol B, 25 µl Sol A ve 250 µl serum koyulur. Vortekslenir ve 42 °C ‘de 1 saat inkübe edilir. Tüpler üzerine 500 µl Sol C koyulur (Sol C, iki fazlı bir solüsyondur. Alt fazından alınması gerekmektedir). Vortekslenir (Süt renginde bir sıvı oluşması beklenir) 10.000 rpm’de 5 dk santrifüj edilir. Oluşan 2 fazdan, üst kısımdaki berrak faz alınarak (~500 µl) temiz bir 1,5 ml nükleaz free tüpe koyulur. Üzerine 500 µl Sol D koyulur. Hafifçe vortekslenerek 10.000 rpm’de 10 dk santrifüj edilir. Süpernatant atılır ve üzerine 500 µl Sol E koyulur. 10.000 rpm’de 5 dk santrifüj edilir. Süpernatant atılır. Tüpler 37 °C etüv veya kuru ısıtıcılı blok yardımı ile kurutulur. Kuruduktan sonra 50 µl distile su ile sulandırılır ve serum içerisindeki mikroorganizma DNA’sı elde edilmiş olur. Parafine Gömülü Dokudan DNA İzolasyonu; 0,2 µm kesitler alınmış örneklerden leblebi büyüklüğünde 1,5 ml nükleaz free tüpe alınır. Üzerine 1 ml Ksilen eklenir. Tüp hafifçe alt üst edilerek parafinin çözülmesi sağlanır. Bu şekilde oda sıcaklığında birkaç dakika beklenir. Doku, 5000 rpm’de 1 dk santrifüj edilerek çöktürülür ve süpernatant pipet yardımıyla uzaklaştırılır. Pelet üzerine tekrar 500µl Ksilen eklenir ve tüp alt üst edilerek yine santrifüj yapılır parafin iyice temizlenir. Süpernatant pipet yardımıyla uzaklaştırılır. Pelet üzerine Ksilen’ i uzaklaştırmak için 1 ml % 99’luk alkol koyulur ve alt üst edilerek karıştırılır, 5000 rpm’ de 1 dk santrifüj edilerek doku çöktürülür. Süpernatant pipet yardımıyla uzaklaştırılır. İkinci yıkama 750 µl % 75’lik alkolle ve 3. yıkama işlemi ise 750 µl dH2O ile yapılır. Her defasında tüp hafifçe çalkalanır, çöktürülür ve süpernatant uzaklaştırılır. Bu işlemle doku parafinden arındırılmış olur. Elde edilen örnek ile 1. adımdan itibaren devam edilerek izolasyon tamamlanır. Tükürükten DNA İzolasyonu; Tükürük örnekleri bir 50 ml tüp içerisindeki ~1ml Sol B içerisine alınır. Sol B içerisinde 6 ay oda sıcaklığında saklanabilir. Solüsyon içerisindeki tükürük örneği ile 1. adımdan itibaren devam edilerek izolasyon tamamlanır. Gaitadan DNA İzolasyonu; Mercimek büyüklüğündeki gaita örneği 1,5 ml tüp içerisine alınır. Üzerine 750 µl kadar Nükleaz free steril su koyulur. Yaklaşık 10 sn vortekslenerek 3000 rpm de 1 dk çevirilir. Süpernatant (~750 µl) temiz bir 1,5 ml tüpe alınır ve bu şekli ile yıkama işlemi 3 kere tekrarlanır. Her defasında pelet atılır ve süpernatant üzerinden işlem yapılır. En son alınan süpernatant (~500 µl) örneği ile 1. adımdan itibaren devam edilerek izolasyon tamamlanır. Sürüntüden DNA İzolasyonu; Sürüntü pamuk uçlu eküvyon ile alınmışsa; 1,5 ml tüp içine 500 µl Sol B koyulur. Eküvyonun örnek alınmış ucu tüp içine daldırılır ve 10 dk bekletilir. Eküvyon alınır tüp içine Sol A eklenerek 1. adımdan itibaren devam edilerek izolasyon tamamlanır. Alıntıdır. Benzer Konular Eczacıların SGK İle Protokolü 31 Mart'ta Bitiyor... Petrograt Protokolü... Paylaş Share this post on Twitter Follow @Forumaski __________________